PEWARNAAN SITOKIMIA HEMATOLOGI

1 PENDAHULUAN

Di laboratorium kadang dengan pewarnaan sediaan hapus darah tepi menggunakan metode Giemsa atau Wright belum memuaskan untuk membedakan seri leukosit untuk menunjang diagnosis leukemia dan kelainan leukosit, oleh sebab itu diperlukan pewarnaan sitokimia lainnya.
Dalam bahasan kali ini membahas mengenai pewarnaan (pulasan) peroksidase, Sudan Black, Periodic Acid Schiff (PAS) dan Leukocyte Alkaline Phosphatase (LAP).

 

2 PULASAN PEROKSIDASE

Adakalanya membedakan jenis leukosit menemui kesukaran, teristimewa jika menghadapi sel muda atau yang abnormal. Dalam keadaan ini boleh digunakan bahwa granula dalam sel jajaran granulosit dan monosit mengandung peroksidase, sedangkan sel jajaran limfosit tidak ada. Pulasan peroksidase yang sering digunakan menurut Sato dan Sekiya.

1.1 Sato dan Sekiya

Larutan yang diperlukan :

1. Larutan Cupri Sulfat : CuSO₄.5H₂O 0,5 gram dalam 100 ml aquadest.

2. Larutan benzidine : benzidine basa 0,2 gram digerus dalam cawan porselin dalam 200 ml aqudest. Disaring dan tambahkan 0,25 ml H₂O₂ 3% dan simpan dalam botol coklat. Tahan selama 6 bulan.

3. Larutan Safranin : safranin 1 gram dalam 100 ml aquadest.

Cara :

1. Letakkan sediaan kering dan difiksasi di atas rak.

2. Genangi sediaan dengan larutan kuprisulfat selama 30 – 60 detik.

3. Buang larutan tadi dan genangi dengan larutan benzidine selama 2 menit.

4. Bilas dan warnai dengan larutan safranin selama 1 menit.

5. Bilas dan keringkan.

Hasil :

Plasma jajaran granulosit berwarna biru sedangkan granula berisi peroksidase akan berwarna hijau biru. Mielobast dengan hasil negatif. Monosit memiliki granula namun terlihat kecil-kecil. Limfosit tidak ada dan berwarna merah.

1.2 Ellias

Larutan yang digunakan :

1. Larutan Chloronaftol. Larutkan 15 mg 4-chloro-1-naftol dalam 2 ml etanol absolut, simpan suhu 4°C.

2. Buffer Tris. Larutan 19,2 ml larutan Tris-(hidroksimetil) aminometan 0,2 mol/L dicampur dengan 80,8 ml HCl 0,1 mol/L, kemudian tambahkan air sampai 500 mL. pH harus 7,4 – 7,6.

3. Larutan H₂O₂ segar : 0,4 mL H₂O₂ 30% diencerkan dalam 100 mL aquadest.

4. Larutan methylgreen 1% dalam aquadest.

Larutan peroksidase dibuat dengan mencampur 2 mL larutan Chloronaftol dengan 38 mL buffer Tris. Kemudian ditambahkan 1 mL H₂O₂.

Cara :

1. Sediaan digenangi dengan reagent peroksidase selama 10 menit.

2. Bilas dengan air dan warnai dengan larutan methylgreen selama 2 menit.

3. Bilas dengan air dan keringkan.

Hasil :

Pulasan ini membuat granula yang peroksidase positif (+) berwarna biru tua.

3 PULASAN SUDAN BLACK

Zat warna Sudan Black memberi warna hitam kepada granula dalam leukosit yang mengandung zat lemak. Antara sudanofilia dan reaksi peroksidase positif terhadap korelasi positif.

Larutan yang diperlukan :

1. Larutan Sudan Black : 0,5 gram Sudan Black B dicampur dengan 100 mL etanol absolut. Biarkan selama 2 hari dan saring.

2. Larutan Buffer : Phenol 16 gram, etanol absolut 30 mL, Na₂HPO₄.12H₂O 0,3 gram dan aquadest 100 mL.

3. Larutan kerja : dicampur 60 mL larutan Sudan Black dan 40 mL Buffer. Saring.

Cara :

1. Sediaan direkatkan dengan uap formalin dalam wadah tertutup selama 10 menit.

2. Genangi sediaan dengan larutan kerja selama 30 menit.

3. Bilas dengan etabol absolut dan bilas dengan air.

4. Bisa juga di warnai dengan safranin 0,1 %.

Hasil :

Granula yang mengandung lipid/lemak akan berwarna hitam.

4 PULASAN PAS (PERIODIC ACID SCHIFF)

Pulasan ini berguna untuk mengenali sel-sel dalam jajaran limfosit yang mengandung glikogen. Reaksi yang terjadi adalah oksidasi glikogen oleh asam periodat (periodic acid) menjadi aldehide, lalu bereaksi dengan reagen schiff menjadi warna merah.

Larutan yang diperlukan :

1. Larutan asam periodat : HIO₄. 2H₂O 1 gram dalam 100 mL aquadest.

2. Reagent Schiff : Basic Fuchsin 1 gram dimasukkan dalam 400 mL air mendidih, biarkan dingin sampai 50°C, saring, tambah 1 mL thionylchloride (SOCl₂), simpan tempat gelap 24 jam, tambah 2 gram carbon adsorbens, kocok saring, simpan lemari es dalam botol gelap.

3. Larutan hematoksilin 2 gram dalam 100 mL aquadest.

Cara :

1. Sediaan hapus direkatkan denga uap formalin dalam cawan petri selama 10 menit.

2. Bilas dengan air selama 15 menit.

3. Genangi sediaan dengan asam periodat selama 30 menit.

4. Bilas dengan aquadest, genangi dengan reagent schiff selama 30 menit.

5. Bilas dengan air, bilas dengan aquadest selama 5 menit.

6. Genangi dengan hematoksilin selama 10 menit.

Hasil :

Granula dalam leukosit yang berisi glikogen menjadi merah.

5 PULASAN FOSFATASE ALKALIS (LAP)

Adanya enzim ini dalam granula dan sitoplasma sel-sel jajaran granulosit dapat dipergunakan untuk membedakannya dari leukosit-leukosit lainnya. Hasil pulasan ini memberikan petunjuk dalam membedakan leukositosis oleh leukemia granulositik kronik dari leukositosis oleh sebab-sebab lain.

Darah segar sebaiknya digunakan : kapiler, darah vena dengan antikoagulan heparin atau double oxalat. Darah EDTA tidak boleh digunakan karena mengganggu pulasan.

Metode Kaplow LAP

Larutan yang diperlukan :

1. Larutan perekat : formalin (40%) 10 mL, metanol absolut 90 mL. simpan dalam lemari es freezzer. Sebagian larutan diambil dan ditaruh pada suhu 5°C.

2. Larutan stok propanadiol : 2-amino-2-metil-1,3-propanadiol 10,5 gram dalam aquadest 500 mL.

3. Larutan kerja Buffer Proponadiol : larutan stock proponadiol 0,2 M 25 mL, larutan HCl 0,1 N 5 mL dan aquadest 100 mL dan pH harus 9,75 dan simpan dalam lemari es.

4. Larutan substrat pH 9,5 – 9,6 : natrium alfa naftil fosfat 35 mg. fast blue RR 35 mg, larutan kerja proponadiol 35 mL, saring. Larutan ini harus segar dan tidak boleh ditunda.

5. Larutan hematoksilin menurut Harris.

Cara :

1. Sediaan hapus digenangi dengan larutan perekat bersuhu 5°C selama 30 detik.

2. Bilas dengan air mengalir selama 10 detik.

3. Genangi sediaan dengan larutan substrat selama 15 menit.

4. Bilas dengan air mengalir selama 10 detik.

5. Pulas tanding dengan larutan hematoksilin selama 4 menit.

6. Bilas dengan air mengalir selama 10 detik dan biarkan kering.

Hasil :

Adanya fosfatase alkalis dalam leukosit ditandai dengan warna coklat muda hingga hampir hitam.

Penilaian :

0 : netrofil tidak berwarna coklat

1 : coklat sangat muda merata, jarang granula.

2 : coklat lebih tua merata, granula sedang jumlahnya.

3 : warna tegas dan granula banyak.

4 : warna tegas dan granula berdekatan dan warna sangat tua.

Skorsing (100 leukosit) :

>100 : LAP tinggi

20 – 70 : LAP normal

<15 : LAP rendah

Interpretasi klinis :

Leukositosis oleh infeksi menghasilkan score LAP tinggi, pada leukemia granulositik kronik score LAP rendah.