ISOLASI BAKTERI DAN TEHNIKNYA

PENDAHULUAN
Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri dulu terbagi menjadi Bacteria dan Archaebacteria, namun sekarang Archaebakteria memiliki domain sendiri yang disebut Archaea.
Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran inti, tidak memiliki organel bermembran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan materi asam nukleatnya berupa plasmid (Postlethwait dan Hopson, 2006).

Bakteri memiliki beragam variasi bentuk, seperti coccus, basil, dan spiral. Bakteri dapat hidup soliter maupun berkoloni dan berkembang biak dengan cara membelah diri. Bakteri memiliki habitat yang bervariasi, dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan, misalnya dalam usus manusia. Bakteri ada yang dapat hidup secara anaerob murni dan akan mati dengan adanya oksigen, ada yang bersifat aerob dan memerlukan oksigen untuk metabolismenya, dan ada yang bersifar aerob fakultatif yaitu dapat hidup pada kondisi anaerob, tapi bila ada oksigen, metabolismenya bersifat aerob  (Betsy dan Keogh. 2005).
Bakteri secara genetis diklasifikasikan menjadi 5 grup besar, yaitu Proteobacteria, Cyanobacteria, Spirocheta, Chlamydia, dan Firmicuta. Proteobacteria merupakan grup bakteri terbesar dan merupakan asal usul mitokondria pada eukariota dengan proses endosimbiosis. Cyanobacteria merupakan grup bakteri yang memiliki klorofil dan dapat berfotosintesis. Spirocheta adalah kumpulan bakteri yang berbentuk spiral. Chlamydia adalah bakteri dengan ukuran yang relatif kecil dibanding grup lain dan umum hidup sebagai parasit. Firmicuta adalah bakteri yang umum memproduksi endspora (Purves dan Sadava, 2003).
Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006).
Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200 bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni yang berasal dari bakteri tunggal.
Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri.  (Harley dan Presscot, 2002).
Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni.
Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan suspensi pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal.
Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal.
Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode untuk mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni.

TEHNIK ISOLASI
Di alam bebas tidak ada mikroorganisme yang hidup tersendiri terlepas dari spesies-spesies lainnya. Sehingga sering kali kuman patogen kedapatan bersama-sama dengan mikroorganisme saprofit. Untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu spesies terdapat beberapa cara yaitu :
1. Penanaman dengan penggoresan ( penanaman pada permukaan agar-agar ), merupakan cara rutin yang dipakai untuk mengasingkan kuman agar didapatkan biakan murni. Sebuah ose (sengkelit) bulat (panjang kawat = 7,5 cm dan diameter 2 mm) digunakan untuk menempelkan bahan pemeriksaan (BP) yang akan dibiakan lalu goreskan pada tepi permukaan perbenihan agar padat dan kering. BP disebarkan tipis-tipis di seluruh permukaan lempeng agar dalam rangkaian garis – garis sejajar pada segmen –segmen lempeng yang berbeda. Sesudah dilakukan pengeraman akan didapatkan pertumbuhan yang rapat pada goresan yang pertama, tetapi selanjutnya pada goresan terakhir akan terlihat koloni-koloni terpisah.
2. Penanaman lapangan (permadani); penanaman lapangan dikerjakan dengan membasahi seluruh permukaan lempeng agar dengan suspensi kuman. Setelah dilakukan pengeraman akan terlihat pertumbuhan kuman yang merata. Biakan ini berguna untuk penentuan jenis kuman dengan bakteriofaga dan uji kepekaan terhadap antibiotika.
3. Biakan agar tabung dikerjakan dengan menggoreskan kuman pada agar tabung biasanya dipergunakan untuk mendapatkan pertumbuhan murni kuman untuk aglutinasi gelas alas.
4. Biakan tusukan; dikerjakan dengan menusukkan ose jarum (p=11cm) yang mengandung biakan / koloni kuman pada perbenihan. Biakan tusukan dipakai untuk menunjukan adanya pencairan gelatin dan mempertahankan biakan baku.
5. Biakan agar tuang; perbenihan agar-agar (15 ml) dalam tabung reaksi dicairkan dan biarkan mendingin dalam penangas air (45-50o C),selanjutnya dituangkan 1 ml biakan yang telah diencerkan sesuai dengan perkiraan pada media agar yang mencair dan diaduk perlahan-lahan. Selanjutnya seluruh isi tabung dituangkan ke dalam lempeng petri, dibiarkan membeku dan setelah dilakukan pengeraman akan tumbuh koloni yang tersebar dalam perbenihan. Cara ini menunjukkan jumlah kuman hidup yang terdapat pada suspensi, dapat digunakan untuk membiakkan air kemih kuantitatif dan perhitungan kuantitatif kuman dalam air / pangan.
6. Biakan cair, terdapat di dalam tabung, botol atau erlenmayer dapat ditanami denan mencelupkan ose yang mengandung kuman. Biakan cair diperlukan untuk menunjukkan biakan yang banyak cepat. Kerugian dari biakan ini adalah tidak dapat membuat biakan murni bahan yang mengandung berbagai mikroorganisme.

PROSEDUR KERJA
Tujuan :
1. Mengetahui cara penanaman kuman pada berbagai jenis media
2. Melakukan isolasi kuman untuk mendapatkan koloni kuman yang terpisah

Cara kerja :
I. PENANAMAN PADA MEDIA PADAT BENTUK PLATE

1. Goresan sejajar : (isolasi)
- Ose dibakar sampai steril, dinginkan.
- Dengan ose yang sudah steril, diambil sampel atau bakteri kultur, dipulaskan disalah satu sisi atau tepi media jangan menyentuh dinding petri dish.
- Dengan ose steril yang lain, pulasan itu digores-goreskan sejajar sampai memenuhi permukaan media.

2. Goresan sejajar melingkar : (isolasi)
- Ose dibakar sampai steril, dinginkan.
- Dengan ose yang sudah steril, diambil sampel atau bakteri kultur, dipulaskan disalah satu sisi atau tepi media jangan menyentuh dinding petri dish.
- Dengan ose steril yang lain, pulasan itu digores-goreskan sejajar pada salah satu tepi media, dengan salah satu sisinya.
- Ose dibalik untuk melanjutkan goresan-goresan sejajar pertama setelah medianya diputar 90o.
- Dengan ose yang dimiringkan goresan-goresan sejajar kedua, digoreskan sejajar lagi setelah media diputar 90o.
- Media diputar 90o, goresan-goresan sejajar yang ketiga digoreskan sejajar lagi dengan ose yang dibalik, sampai memenuhi permukaan media plate

3. Cara taburan : (isolasi dan memperbanyak).
- Suspensi sampel cair atau kultur bakteri di dalam media cair diambil dengan pipet steril sebanyak 0,1 ml diteteskan dipermukaan media plate tepat ditengah- tengahnya.
- Dengan mengunakan spatel yang terbuat dari kaca atau kawat, yang sudah steril dan dingin, tetesan itu diratakan pada seluruh permukaan media plate.

4. Cara penuangan : (penghitungan)
- Suspensi sampel/sampel cair diteteskan ke dalam petri dish steril sebanyak 0,1 atau 1 ml secara steril.
- Dituangi media padat steril yang dicairkan sebanyak sampai menutupi semua permukaan dasar petri dish.
- Campur baik-baik, tunggu sampai agar-agarnya membeku.
- Dibalik, masukan ke Inkubator 37oC 48 jam.
Catatan : media yang digunakan tergantung dari jenis bakteri yang dihitung.
Pembacaan :
- Pertumbuhan bakteri pada media padat disebut koloni, yaitu kelompokan-
kelompokan bakteri yang tumbuh pada media tersebut.
- Koloni bakteri pada media padat denga tujuan isolasi dapat dibedakan
berdasarkan kriteria sebagai berikut :
1. Ukuran : diukur berapa diameternya dengan satuan mm
2. Warna : putih, kuning, hitam, hijau, merah, dan sebagainya
3. Bentuk : bulat, serabut, bergelombang, rhizoid, dan sebagainya
4. Permukaan : datar, cembung, cekung, kasar(rough), halus(smooth)
5. Sifatnya : keruh, jernih, kering, berlendir, melekat pada pembenihan, menjalar, hemolitis, anhemolitis, dan sebagainya.
- Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat bentuk plate, dengan tujuan memperbanyak, yang penting diperhatikan selain adanya pertumbuhan koloni juga kemurnian koloni itu.
- Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat bentuk plate, dengan tujuan penghitungan kriteria koloni tidak perlu diperhatikan, tetapi tinggal dihitung saja.

Materi Isolasi Bakteri bisa anda download disini.