PEWARNAAN GRAM

PENDAHULUAN
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.
Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin.
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Pewarnaan gram merupakan prosedur yang paling bermanfaat dalam Mikrobiologi diagnostik. Ketika dicurigai adanya infeksi bakteri, sebagian besar bahan yang diserahkan harus diapus pada glas objek dan diwarnai gramkemudian diperiksa secara mikroskopik. Pada pemeriksaan mikroskopik reaksi gram dan morfologi bakteri harus diperhatikan . Terlihatnya bakteri pada apusan pewarnaan gram tidak berarti dapat melakukan identifikasi sampai spesies. Beberapa bakteri gram positif tak hidup dapat terpulas secara gram negatif. Biasanya, morpologi bakteri ditetapkan dengan menggunakan organisme yang ditumbuhkan pada agar. Namun, bakteri dalam cairan atau jaringan tubuh dapat mempunyai morpologi yang sangat beragam.
Dinding sel yang tebal pada gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi menyebabkan pori-pori dinding sel menutup, sehingga mencegah larutnya kompleks ungu kristal yodium pada langkah pemucatan, sedangkan sel-sel gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol aceton. Larutnya lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan berlangsung lebih cepat.
Faktor-faktor lain yang juga menimbulkan keragaman dalam reaksi gram:
1. Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan.
2. Kerapatan sel pada olesan.
3. Konsentrasi dan umur-umur reagen yang digunakan untuk pewarnaan gram.
4. Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang digunakan.
5. Sejarah biakan.



PROSEDUR KERJA
Metode : Gram stain
Tujuan : Untuk menentukan kuman gram positif dan gram negatif
Prinsip : Kuman gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding sel oleh pencucian dengan alkohol, protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks ungu kristal iodium dipertahankan dan sel tetap ungu. Sedangkan kuman gram negatif melarutkan zat lipid selama pencucian dengan alkohol, pori-pori pada dinding sel membesar sehingga zat warna yang sudah diserab mudah dilepas, kemudian mengambil zat warna merah dari fuchsin.

Pewarnaan gram adalah satu teknik pewarnaan untuk mengidentifikasi bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Teknik pewarnaan ditemukan oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884. Ada 2 teori tentang pewarnaan gram. pertama teori Salton dan kedua teori permeabilitas dinding sel. berikut penjelasannya :

Teori Salton

1. Pada bakteri gram negatif kadar lipid dalam inti sel tinggi 20%, lipid larut dalam gram C ( alkohol ), pori-pori sel membesar.
2. Pada bakteri gram positif pencucian dengan gram C ( alkohol ) menyebabkan denaturasi protein pada dinding sel, lalu protein mengeras dan pori-pori sel mengecil.

Teori permeabilitas dinding sel

1. Pada bakteri gram positif lapisan peptidoglikan ada sekitar 3 lapisan kompak.
2. Pada bakteri gram negatif lapisan peptidoglikan tipis sekitar 2 lapisan tak kompak.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan gram :

• Keasaman
• Pelunturan
• Umur biakan
• Perlakuan khusus

Prinsip pewarnaan gram

• Dinding sel bakteri gram positif terdiri atas lapisan Peptidoglikan yang tebal menjadikan afinitasnya tinggi terhadap Kristal violet dan iod membentuk senyawa sukar larut dalam alkohol, sehingga tetap memegang kuat zat utama ( berwarna ungu ).
• Dinding sel bakteri gram negatif mengandung lapisan lemak dan karbohidrat yang afinitasnya rendah terhadap cat utama dan mudah luntur atau larut dalam alkohol, selanjutnya akan menerima atau memegang cat lawan ( berwarna merah ).

Cara Kerja :
• Buat sediaan kuman dan fiksasi.
• Diwarnai dengan gentian violet selama 3 menit, cuci dengan air mengalir
• Diwarnai dengan lugol selama 1 menit, cuci dengan air mengalir.
• Digenangi dengan alkohol 96% sampai zat warna larut, cuci dengan air mengalir.
• Diwarnai dengan fuchsin selama 2 menit, cuci dengan air mengalir
• Keringkan dan periksa dibawah mikroskop

Interpretasi hasil : Gram positif : kuman berwarna ungu
Gram negatif : kuman berwarna merah.

Pembahasan

• Pada pengecatan dengan gram A, semua bakteri akan berwarna violet.
• Pada pengecatan dengan gram B terjadi peubahan, warna bakteri menjadi violet tua-hitam.
• Pada pengecatan dengan gram C bakteri gram positif tetap berwa sedangkan bakteri gram negatif menjadi tidak berwarna atau pucat violet.

• Pada pengecatan dengan gram D bakteri gram positif tetap berwarna violet, sedangkan bakteri gram negatif menjadi berwarna merah.